Světelné, rentgenové, elektronové… Typů mikroskopů existuje celá řada a mnohé z nich dosahují skvělých výsledků. Přesto vědci a vědkyně neustále pracují na vývoji nových technologií. Následující text, převzatý z čtvrtletníku Akademie věd ČR A / Magazín, představuje dvě novinky. Tou první je holografický endoskop Tomáše Čižmára z Ústavu přístrojové techniky AV ČR, který pomocí optického vlákna proniká do nitra mozku. Druhý přístroj vyvinula Barbora Špačková z Fyzikálního ústavu AV ČR, jejím nanofluidním mikroskopem si můžeme „posvítit“ na biomolekuly, tedy základní stavební kameny života.
Životy obyčejných lidí někdy mění historii. A někdy ji výrazně ovlivní i jejich smrt. Jednapadesátiletou Auguste Deterovou přivedli 25. listopadu 1901 na vyšetření do Městského ústavu pro mentálně postižené ve Frankfurtu nad Mohanem. Byla zmatená, zapomnětlivá a prudce se jí měnily nálady, nepoznávala své okolí a nevzpomínala si, kde bydlí nebo že je vdaná. Lékař, který ji dostal na starosti, se jmenoval Alois Alzheimer.
Podobné příznaky znal od mnohem starších pacientů. Žena proto upoutala jeho pozornost. V rozhovorech s ní zaznamenal její nekompletní a pomatené odpovědi a pečlivě si zapisoval projevy její choroby. Když zemřela, dostal unikání příležitost prozkoumat její mozek. Umístil jeho vzorky pod mikroskop a všiml si v nich významných změn – silného úbytku neuronů a změti „klubíček“ tvořených neurofibrilami (vlákny).
Od časů Aloise Alzheimera uplynulo už více než sto let a možnosti mikroskopie se od té doby neuvěřitelně posunuly. Vedle mikroskopů světelných existují rentgenové, elektronové, mikroskopy atomárních sil a mnoho dalších. Přesto vědci a vědkyně neustále vyvíjejí nové.
Současné mikroskopické techniky sice dokážou zviditelnit dříve naprosto netušené detaily, jenže jejich nevýhodou je nutnost upravovat vzorky – například je zmrazit, umístit je do vakua, v podstatě je „zabít“. Což může být problém, chceme-li zkoumat živou tkáň – třeba v reálném čase pozorovat, co se děje v hloubi nemocného mozku nebo jak se chovají molekuly DNA.
Dva unikátní objevy českých vědců však mají ambici tuto nedostatečnost současné mikroskopie překlenout. Prvním je holografický endoskop, jehož cílem je proniknout dovnitř mozku a pozorovat aktivitu nervových buněk. Druhým je nanofluidní rozptylový mikroskop, který umí světlem zachytit a pozorovat jednotlivé biomolekuly v jejich přirozeném stavu.
Od optické pasti k mozku
Zobrazování mozku je i v dnešní době stále velkou výzvou. Vytvořit sondu, která by pronikla dostatečně hluboko, aby zviditelnila propojení jednotlivých neuronů, je extrémně složité. Současné zobrazovací techniky s sebou totiž nesou riziko poškození citlivých mozkových tkání.
Změnu by mohl nabídnout speciální holografický endoskop, jenž využívá jedinečných vlastností světla vedeného optickým vláknem velikosti lidského vlasu. Na jeho vývoji pracuje Tomáš Čižmár (na snímku), který působí v brněnském Ústavu přístrojové techniky AV ČR a zároveň vede oddělení pro vývoj optických vláken v Leibnizově institutu fotonických technologií v německé Jeně.
„K mozku jsem se vlastně dostal úplnou náhodou. Nikdy jsem si prvoplánově neřekl, že se chci zabývat právě jeho výzkumem,“ vzpomíná. Shodou náhod se dostal i k celému oboru optiky a fotoniky, ještě v magisterském studiu na brněnské Přírodovědecké fakultě se totiž věnoval fyzice plazmatu. Jenže pak přišla osudová exkurze do Ústavu přístrojové techniky AV ČR, konkrétně do výzkumného oddělení mikrofotoniky Pavla Zemánka.
„Zabývali se tam výzkumem optických pastí a vývojem optické pinzety. Když jsem viděl, co všechno světlo umí, úplně mi spadla brada. Hned mi bylo jasné, že bych to chtěl také dělat,“ říká Tomáš Čižmár, který se záhy k týmu Pavla Zemánka přidal coby doktorand.
Optická past nabízí způsob, jak pomocí světla zachycovat malinké objekty v rozměrech mikrometrů a manipulovat s nimi. Optická pinzeta je pak jednou z nejrozšířenějších optických pastí. Vědeckému týmu z oddělení mikrofotoniky se podařilo některá zařízení tohoto typu dokonce uvést na trh, například ve spolupráci s firmou Meopta. (O výzkumu Pavla Zemánka, nositele prestižní Akademické prémie za rok 2020, jsme psali v časopise A / Věda a výzkum 2/2021.)
Optickým pastem se Tomáš Čižmár věnoval i na počátku svého postdoktorandského pobytu na skotské Univerzitě v St Andrews. Jeho úkolem bylo vytvářet zajímavá prostorově strukturovaná optická pole využitelná k manipulacím mikroobjektů.
Dráždilo ho tehdy, jak často se při práci s optickými svazky setkával s jejich aberacemi (odchylkami nebo poškozeními). Optická aberace vede k tomu, že se bod nezobrazí ve své skutečné podobě, ale jako rozmazaná skvrna s nerovnoměrným rozdělením intenzity. S tímto jevem se do určité míry potkávají lidé s oční vadou zvanou astigmatismus, která se koriguje brýlemi s cylindrickým zabroušením skel.
Tomáš Čižmár nad problémem dumal a zkoušel různé možnosti. Dlouho hledal rozuzlení v optických systémech, které ale byly stále více a více aberované. „Nakonec jsem si uvědomil, že řešení je aplikovatelné i na zcela opticky náhodná média, jako je optické vlákno,“ vzpomíná vědec.
Optická soustava sestává ze změti různých zrcátek, čoček, drátků a šroubků, kterou prochází laserové světlo.
Zkrocení světla
Optická vlákna se zpravidla používají pro přenos rychlého internetu. Bývají imunní vůči elektromagnetickému rušení a signály přenášejí na delší vzdálenosti a s vyšší rychlostí. Čím dál častěji tak nahrazují dříve dominantní kovové vodiče. Vyrobené jsou ze skla, případně plastu.
Při výzkumu v St Andrews ale nešlo o přenos internetu, ale o účinné „zkrocení“ světla, které může vytvářet krásná optická pole bez poruch (aberací). Jednou z potenciálních aplikací je zobrazování biologických tkání – třeba právě v mozku. „Použití v neurovědách se nabízelo, protože bylo evidentní, že to je přesně to, co jim chybí – možnost nahlédnout hlouběji do mozku a ukázat, co zajímavého se v něm děje,“ doplňuje vědec.
Záhy přišla Tomáši Čižmárovi pracovní nabídka z Univerzity v Dundee a následovalo udělení dvou důležitých grantů – jeden od Evropské výzkumné rady (prestižní ERC grant) a druhý určený na podporu excelentních týmů v Česku (financovaný hlavně z Evropského rozvojového regionálního fondu). Oba granty byly udělené na stejné období (od roku 2017 do roku 2022).
„Bylo to poměrně hektické období, protože jsem se ze Skotska i s rodinou přesunul do Německa a zároveň jeden z projektů běžel v Brně v mém původním domovském ústavu. Pracoval jsem tak se dvěma týmy zároveň a nebylo snadné vše zkoordinovat,“ vzpomíná vědec. V obou projektech už se naplno věnoval rozvoji holografického endoskopu – přístroje, který využívá výhody optického vlákna pro usměrnění světelného svazku.
Na začátku celé soustavy je laser zhruba velikosti krabice od bot. Ten posílá světlo optickým kabelem k zařízení složenému z čoček a zrcadel. V něm se světlo rozdělí a přesměruje k počítačem řízenému holografickému modulátoru o rozměrech větší krabičky od sirek. Ten světlu vtiskne vlastnosti, jaké jsou k dané aplikaci potřeba.
Takto upravené světlo se zavede do speciálního, tzv. multimodového optického vlákénka širokého zhruba desetinu milimetru. To už je pak připravené k průniku do živočišné tkáně, v tomto případě do mozku. Konkrétně do mozku modelového organismu lidské nemoci (většinou se jedná o laboratorní myš). Zvířecí modely umožňují neurovědcům lépe porozumět, jak funguje mozek, a zjištěné poznatky se pak dají využít v dalším medicínském nebo farmaceutickém výzkumu.
Vesmír myšího mozku
Práce s myšími modely podléhá přísné etické kontrole, žádné ze zvířat by nemělo zbytečně trpět. Kraniotomie (tedy vyvrtání otvůrku pro vložení vlákna) probíhá v anestezii. Samo zavedení vlákna dovnitř mozku myš necítí a lze jej tak aplikovat v době, kdy je zvíře aktivní. Velkou výhodou proti dosavadním endoskopickým metodám je miniaturní velikost sondy, a tudíž nutnost mnohem méně invazivního zásahu do mozku.
K zviditelnění neuronů a dalších částí mozku, které potřebují vědci sledovat, se používají různé fluorescenční značky. Tedy laicky řečeno se buňky a jejich okolí obarví (dělá se to například genetickou manipulací vzorku nebo virální transfekcí – to, co barevně svítí, je pak protein, který buňka v reakci produkuje).
Jak vlákno prostupuje myším mozkem, zobrazuje se na monitoru počítače celý vesmír do sebe propletených a pospojovaných neuronů. „Vidíme na něm různé detaily, třeba jak z neuronu směřují výběžky, kterým se říká dendrity. Na něm jsou trny – struktury, kde si neurony předávají informace pomocí synapsí. Je to poměrně dynamická struktura, takže spoustu vědců zajímá, jak se aktivují, jak jednotlivé části neuronů vznikají, jak navazují spojení, jak jsou aktivní,“ přibližuje Tomáš Čižmár.
Upravené světlo se zavádí do tzv. multimodového optického vlákénka širokého zhruba desetinu milimetru. To proniká do mozku myši, modelového organismu lidské nemoci (na obrázku je plastový myšák).
Jím a jeho týmem vyvíjený holografický endoskop je už nyní připravený k použití. O přenos do praxe se stará spin-off s názvem DeepEn, který český vědec spolu s kolegy založil v Německu. Přístroj nyní prezentují na neurovědeckých konferencích, pořádají workshopy a vysvětlují, jak se používá. Zájem o něj projevily různé vědecké instituce, především ty se zaměřením na výzkum mozku, vývoj a aktivitu nervových buněk a jejich degeneraci.
Zdálo by se, že je hotovo. Zdaleka ne. Tomáš Čižmár spolu s kolegy z Brna i z Jeny nadále pracuje na zdokonalování přístroje. Další metou je přizpůsobit zařízení tak, aby se zkoumané myši mohly volně pohybovat. Nyní totiž endoskop spolehlivě funguje, když má myška k hlavě připevněný držák se sondou a běhá pouze na podložce pod držákem. Přitom vlákno díky své plasticitě a ohebnosti teoreticky umožňuje, aby mozkovou činnost zvířete monitorovalo v jeho přirozeném prostředí. Jenže to zatím nejde. Při nekontrolovaném pohybu zvířete se totiž světlo ve vlákně nežádoucím způsobem promíchá a zkreslí přenášenou informaci.
A co použít holografický endoskop přímo v lidského mozku? Podívat se v reálném čase na mozek pacientky, jakou byla Auguste Deterová z úvodu článku, by bylo jistě lákavé. A technicky by to šlo. Ale brání tomu různé překážky. V lidském těle například není snadné použít fluorescenční značení (které znamená zásah do živého organismu). „Benefit pro člověka je ale jasný. Spočívá především v zobrazování a studování dané nemoci u zvířecích modelů,“ doplňuje vědec.
Ochočené světlo?
Světlo má unikátní fyzikální vlastnosti a čím více jej poznáváme, tím lépe jej umíme využít. Světlem jsme se naučili manipulovat s miniaturními předměty, a dokonce je třídit, přenášíme jím informace, světlem spoutaným v laserech měníme strukturu materiálů, světlem obrábíme i řežeme. Přesto ještě úplně všechny možnosti, které nám nabízí, využít neumíme.
„Máme ještě spoustu mezer. Světlo jsme si ochočili jen do určité míry. Velkou výzvou například stále zůstává, jak jej efektivně tvarovat v prostoru i čase. Kdyby se to podařilo, otevřely by se úžasné aplikační možnosti třeba v medicíně, “ dodává Tomáš Čižmár.
Spoutat světlo a využít jeho vlastnosti například právě pro medicínský výzkum se snaží mnoho vědců a vědkyň. Z trochu jiného úhlu pohledu k němu přistupuje Barbora Špačková z Fyzikálního ústavu AV ČR. Také její výzkum ale může v důsledku pomoct pacientům, jako byla Auguste Deterová.
„Pro většinu z nás je světlo prostředkem, který nám umožňuje vidět. Co je ale překvapivé – pro nanosvět, v němž se můj výzkum odehrává, je světlo neuvěřitelně hrubým a nepřesným nástrojem,“ uvádí Barbora Špačková. Vlnová délka světla je totiž asi stokrát větší než velikost objektů, na které se ve své práci zaměřuje. „Je fascinující, že dokážeme světlo obelstít a využít jej nejen pro sledování nanoskopických objektů, ale i jejich měření a vážení,“ dodává.
Objekty jejího zájmu jsou biomolekuly – základní stavební kameny veškerého života. Jsou až stotisíckrát menší než prachové částice a pro konvenční optickou mikroskopii jsou tak neviditelné. Jsou ale také nesmírně rychlé. Ve svém přirozeném vodném prostředí se pohybují na vzdálenosti stovek nanometrů v rámci jedné milisekundy.
Jak se dá takový superpohyblivý a neviditelný nezmar zobrazit a zaznamenat? „Velmi těžko, je to jako hledat pobíhající černou kočku v černé místnosti. A často ani nevíte, jestli tam opravdu je,“ nabízí paralelu vědkyně. Tento problém se daří obejít díky fluorescenční mikroskopii, která na pozorovanou molekulu naváže fluorescenční značku, sloužící jako maják ve tmě. Značka ale může chování studované molekuly výrazně ovlivnit. Pozorovat molekuly bez značky je obtížné, ale ne nemožné. Barboře Špačkové se tento zapeklitý problém podařilo vyřešit.
Původně se přitom zabývala jinými vědeckými úkoly. A podobně jako u Tomáše Čižmára se osudová tematická výhybka uskutečnila v zahraničí. V jejím případě na Chalmersově technické univerzitě ve Švédsku, kam odjela jako postdoktorandka v roce 2017. Chtěla tam rozvíjet biosenzory vhodné pro detekci chemických a biologických látek, jako jsou například škodliviny v ovzduší nebo biomarkery v krvi. Což bylo téma, jemuž se věnovala ve svém někdejším domovském Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR.
Jednoho dne jí kolegové ve švédské laboratoři ukázali optický jev, který jim v jejich projektu vadil a chtěli se ho zbavit. Nevěděli, proč takhle funguje, ani k čemu by mohl být dobrý. Barboru Špačkovou problém zaujal a rozhodla se, že ho detailněji prozkoumá. Zahloubala se do příslušné teorie, analyzovala různé možnosti a zjišťovala, jak by se světlo mělo v určitých situacích chovat. Třeba pokud by se setkalo s biomolekulou.
A teorie naznačovala, že by světlo v tomto případě mohlo být schopné biomolekulu vidět. Nabízelo se proto sestrojit unikátní mikroskop, který bude schopný zviditelnit biomolekulu v jejím přirozeném vodném prostředí. „Dostala jsem tehdy neuvěřitelnou podporu od šéfa. I podle něj by to byla bomba, pokud by to fungovalo. Zeptal se, co potřebuju pro rozvoj nápadu – laboratoř? Čas? Vybavení? Myšlenka vypadala natolik lákavě, že mi zajistil všechny podmínky pro její realizaci,“ říká Barbora Špačková.
Barbora Špačková s nanofluidním rozptylovým mikroskopem
Světlo zakleté v trubce
Prototyp mikroskopu skutečně po několika měsících intenzivní činnosti vznikl. „Na okamžik, kdy jsem v našem přístroji poprvé uviděla molekulu DNA, se asi nedá zapomenout. Bylo to shodou okolností v ten samý den, kdy média zveřejnila úplně první fotografii černé díry,“ vzpomíná výzkumnice na 10. dubna 2019.
Metodu vědci pojmenovali nanofluidní rozptylová mikroskopie. Nanofluidika je obor zabývající se prouděním tekutin v nanorozměrech a je to disciplína, na níž se specializuje tým Christopha Langhammera, ve kterém badatelka ve Švédsku působila.
Nanofluidní zařízení můžeme připodobnit k miniaturnímu potrubí, kterým proudí tekutina. „Trubka“ je ze skla a je vyrobená elektronovou litografií (místo rydla používaného v klasické litografii se v tomto případě daná struktura kreslí elektronovým svazkem).
Pro zviditelnění pozorované biomolekuly v „trubce“ vědkyně využila princip interference světla. Při ní se světelné vlny vzájemně ovlivňují, což posiluje jejich účinek. „Při interakci dvou světelných vln se jejich intenzita jednoduše nesčítá, jedna a jedna v tomto případě může být dvě, ale klidně i nula nebo čtyři,“ popisuje Barbora Špačková.
Aparatura nanofluidního mikroskopu se velikostně podobá holografickému endoskopu Tomáše Čižmára. Oba se vejdou do menší místnosti velikosti panelákové koupelny. Přístroj vyvinutý Barborou Špačkovou a jejími kolegy také sestává ze soustavy zrcátek a čoček, kterou prochází laserové světlo.
Vzorek zkoumané tekutiny – ať už se jedná o sekret buněk, nebo třeba krevní plazmu – se aplikuje na nanofluidní čip. Jde o čtvercovou destičku o rozměrech přibližně centimetr na centimetr, která obsahuje sérii větších mikroskopických kanálů, kterými se kapka tekutiny dostává do menších nanofluidních kanálů. V ní dochází k interakci světla s molekulou, jeho rozptylu a interferenci. Molekula se pak zobrazí na monitoru počítače jako pohybující se tmavý „flek“.
Pro laiky by to mohl být jen flek, ale biofyzikové a biochemici bývají z tohoto záznamu podle slov Barbory Špačkové nadšeni. Pozorování pohybu a interakcí molekul nejen otevírá unikátní okno do života biomolekul, ale tato metoda také dokáže jednotlivé molekuly detailně analyzovat, změřit i zvážit!
A tak se slibně rozbíhají první spolupráce s laboratořemi vědeckých institucí i farmaceutických firem. Za účelem transferu objevu do praxe vznikla už ve Švédsku spin-off společnost Envue Technologies. Barbora Špačková navíc dále pracuje na další generaci přístroje, která kromě lepšího rozlišení nabídne další funkcionality, jako je možnost s jednotlivými molekulami manipulovat nebo měřit jejich náboj.
V rozvoji mikroskopu už vědkyně pokračuje v České republice, kam se i s rodinou vrátila v roce 2022. Zázemí našla ve Fyzikálním ústavu AV ČR, kde od 1. července 2024 vede Dioscuri centrum jednomolekulární optiky iniciované a podporované německou Společností Maxe Plancka. Na novém pracovišti najde uplatnění šest vědců nebo vědkyň, do výběrového řízení se zatím hlásí zejména doktorští studenti ze zahraničí. Díky štědré podpoře bude možné kandidáty adekvátně zaplatit, což v české vědě nebývá úplně samozřejmé. Centrum chce angažovat mladé výzkumníky se základem ve fyzice, kteří se orientují i v biochemii, biofyzice, mají zkušenosti s mikroskopií nebo nano- či mikrofluidikou.
Centra Dioscuri
Jde o centra vědecké excelence, jejichž vznik v zemích střední a východní Evropy iniciuje a finančně podporuje německá Společnost Maxe Plancka. Několik jich už funguje v Polsku, v roce 2024 se tři otevřela v Česku. Vedle Dioscuri centra jednomolekulární optiky Barbory Špačkové se jedná o Dioscuri centrum pro spinkaloritroniku a magnoniku Heleny Reichlové (obě centra mají základnu ve Fyzikálním ústavu AV ČR). Dioscuri centrum pro biologii kmenových buněk a metabolických onemocnění vzniklo při brněnské Masarykově univerzitě a vede jej biolog Peter Fabian. Centra získávají finanční podporu v přepočtu zhruba
36 milionů korun na dobu pěti let. Finance rovným dílem poskytují Spolkové ministerstvo školství a výzkumu a české Ministerstvo školství, mládeže a tělovýchovy.
Přečtěte si článek o slavnostním otevření českých Dioscuri center na webu AV ČR z května 2024, z nějž pochází i přiložená fotografie.
Proletět se nanovesmírem
„Vydáváme se na cestu biologickým nanovesmírem jako nanoskopičtí průzkumníci objevující základní stavební kameny života,“ používá poetický příměr Barbora Špačková. Nezůstane však jen u kochání se krásami skrytých zákoutí nanosvěta. Ve spolupráci s molekulárními biology se její tým chce zaměřit na konkrétní otázky týkající se molekulárního transportu v buňkách nebo procesů, které souvisejí třeba právě s rozvojem zmíněné Alzheimerovy choroby.
Auguste Deterové už současné výzkumy mozku nepomůžou, je po smrti více než stovku let. Počet lidí s podobným osudem ale neustále vzrůstá. Jen v České republice trpí podle odhadů Alzheimerovou chorobou asi 150 tisíc lidí a do roku 2050 se má toto číslo téměř zdvojnásobit.
Jestli se vědkyním a vědcům podaří tento děsivý odhad zvrátit, je ve hvězdách. Jisté ale je, že díky objevům jako nanofluidní rozptylový mikroskop či holografický endoskop si na „alzheimera“ mohou „posvítit“ dosud nevídaným způsobem.
Text vyšel jako součást hlavního tématu čtvrtletníku Akademie věd ČR A / Magazín 3/2024. (24.12.2024)